乳酸杆菌(LB)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
规格：50次
价格：5860元
产品及特点
乳酸杆菌是可使葡萄糖等糖类分解为乳酸的各种细的总称。乳酸菌是一种无芽孢 的杆菌，属革兰氏阳性菌，厌氧性呼吸。广泛分布于自然界，有些菌株是人和动物口 腔、肠道及道的正常菌群之一，很少致病，除极偶尔引起亚急性细性心内膜炎外， 对人基本无害。寄生于口腔的乳酸杆菌在龋齿发生中起重要作用。一般认为寄生于肠 道和道的乳酸杆菌对机体有保护作用某些乳杆菌如嗜酸性乳杆菌、保加利亚乳杆菌， 常用于饮料的发酵工业。本公司开发乳酸杆菌属通用染料法荧光定量 PCR 试剂盒，它 具有下列特点： 1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。 2. 引物根据乳酸杆菌属专一区设计，特异性高。 3. 荧光定量 PCR 检测，比常规 PCR 更加灵敏。 4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。 5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。 6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。
乳酸杆菌属通用染料法荧光定量PCR试剂盒规格及成分
成分 |
编号 |
十孔盒包装 |
2×qPCR MagicMix |
A |
500μL（棕色管） |
荧光 PCR 专用模板稀释液 |
1 mL（黄盖） |
|
乳酸杆菌属通用PCR 引物混合物 |
C |
100μL（白盖） |
乳酸杆菌属通用 PCR 阳性对照(1×10E8 拷贝/μL) |
D |
50μL（红盖） |
DNA 病毒裂解液（试用装） |
E |
15 次（9 mL） |
使用手册 |
F |
1 份 |
运输及保存：低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。
乳酸杆菌属通用染料法荧光定量PCR试剂盒使用方法
一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。
2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（*好用带芯枪头，下同）。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
8. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL上步制备的PCR 阳性对照的第4号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5拷贝/μL，10μL 相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。
9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒DNAout 或其升级版柱式病毒DNAout。本试剂盒免费赠送15次一管式病毒DNAout。
三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
10. 如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个
样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后*后加）：
成分 |
样品管 N+2 个 |
PCR 阴性 对照管 |
PCR 阳性 对照管（2-7 管） |
2×qPCR MagicMix （棕色管） |
10 μL |
10 μL |
各 10 μL |
乳酸杆菌属通用 PCR 引物混合液（白盖） |
2 μL |
2 μL |
各2 μL |
自备 10×ROX (见注) |
2 μL |
2 μL |
2 μL |
N+2 待测样品 DNA 模板 |
6 μL |
不加 |
不加 |
第 7 步所得 PCR 阳性对照稀释液（2-7 号） |
不加 |
不加 |
各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…） |
注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光PCR仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。
12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。
过程 |
温度 |
时间 |
预变性 |
92℃ |
5 分钟 |
PCR 反应（35 个循环） |
94℃ |
60 秒 |
50℃ |
60 秒 |
|
72℃ |
60 秒 |
13. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时，*大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的*大吸收光谱在 500 nm，*大发射光谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。
四、数据处理
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。
15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。
五、荧光定量PCR技术的基础理论：
1、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析 、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析。
左图横坐标是PCR循环次数，纵坐标是总的荧光强度Rn,改图反映的是各个样品随着 左图横坐标是PCR循环次数，纵坐标是总的荧光强度Rn,改图反映的是各个样品随着 每轮PCR反应，其总的荧光量的实时变化；右图横坐标也是PCR循环次数，纵坐标是 每轮PCR反应，其总的荧光量的实时变化；右图横坐标也是PCR循环次数，纵坐标是 总的荧光强度与荧光本底的差值RT RB即△Rn的对数，在右图中确定阈值线，该直 总的荧光强度与荧光本底的差值RT –RB即△Rn的对数，在右图中确定阈值线，该直 线上所有样品的RT RB的对数都相同，荧光定量PCR的线性关系才会成立。 线上所有样品的RT –RB的对数都相同，荧光定量PCR的线性关系才会成立。
