如何把细胞养的更漂亮Ⅲ（污染拯救篇）！看完再也不怕细胞污染！

如何把细胞养的更漂亮Ⅲ（污染拯救篇）！看完再也不怕细胞污染！

对于细胞培养防止污染的措施等注意事项，相信各位园子里的朋友们呢都知道的差不多，其实实际情况也就是那些步骤了，主要就是在于各位操作的娴熟程度了。所以这个预防还是在于大家的锻炼。我今天主要谈细胞污染之后的拯救。继续我的专题！

7.细胞污染之后的拯救！

对于贴壁生长的细胞，相对来说比较简单但很麻烦。以下我主要讨论贴壁生长的细胞。

在讨论之前，大家首先要有一个概念，即洁净区，并不是没有**，而是**的数量非常少，国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米，沉降菌数不得超过1个每培养皿.而国外的标准比我国的还要高一点，要求的数量更少。

所以在我们的洁净操作台里，并不是真正一个**都没有的，所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系**的数量。

所以处理**污染的重要原则就是：无限地稀释**的浓度，无限地减少**的数量！

1）.将污染的培养液倒掉，转烧瓶口，加入10mlPBS，适当晃动清洗培养瓶，然后倒掉。转烧瓶口。

2）.继续加入10mlPBS，同样方法晃动，清洗培养瓶，然后倒掉。

3）.继续加入5mlPBS，同样方法洗瓶，主要是培养面，然后倒掉。

4）.重复步骤3再洗。

5）.重复步骤3再洗。

6）.加入3-5ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。

7）.加入3ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。

8）.再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。

9）.加入10ml培养液，加入2ml双抗，放置培养箱培养，5小时之后，倒掉培养基，加入PBS洗瓶两次，然后加入胰酶消化，吹打后置于离心机800-1000r/min离心，然后洗一次。置于新的培养瓶里培养，培养体系加入2ml双抗。

10）.24h之后，视情况换液，若仍然污染严重，培养基浑浊，重复以上步骤，若看不到污染物，则继续步骤1)、3）、4）、6）、8），然后加入培养液培养，培养体系加入2ml双抗.

11).24h之后，若仍污染严重，可再重复一次，若还污染只能弃之（不过一般没有出现这种情况），若镜下不见污染物，则换液PBS洗瓶，正常培养。

以上是对于**污染（常见为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）；若为霉菌或者**污染，加入两性霉素B清洗和培养，终浓度一般为2.5μg/ml（在30μg/ml时会有细胞毒性）。另外也可以选择在培养基里加3ug/ml的制霉菌素或放线菌素D。其它操作同；若为支原体或者黑胶虫污染，因为这个太难处理，所以我基本上都是重新弄细胞了。处理的代价更大更麻烦。但是也是有专门针对黑胶虫和支原体污染的试剂的，但是我没有试过。比较贵呵呵。

有同学说用泰乐处理支原体污染效果比较好。大家可以试试，我下次也会试一试。至于黑胶虫的话，我觉得真的是没有办法了，还是需要你在无菌观念和无菌操作上下大功夫加强了，真的黑胶虫在科研领域还是很未知的啊。所以没有什么好的应对方法。预防为主！！还是要强调无菌操作啊！！尤其注意血清的质量！这个是主要来源。一般建议用北美血清，这个黑胶虫污染会概率小。

以上方法主要是针对贴壁生长的细胞，在操作的过程中，一定要小心操作动作，轻柔缓慢，切忌大动作鲁莽。防止细胞脱落。以上方法操作得当，基本上都能救活你的细胞（我还没有听到没救活的反馈）。当然如果你的细胞仍有富余或者冻存的，我还是建议你把污染的扔掉，再复苏方便省事。这个拯救细胞还是主要针对你就只剩这一瓶细胞无路可退的时候。