内**对ELISPOT检测的干扰

l背景知识

我们都知道，内**的化学本质是革兰氏阴性**的脂多糖。它可以激活**细胞的受体TLR4 (Toll like receptor4)和TLR2，从而引发**细胞内一系列的反应，包括产生一系列细胞因子，从而启动先天**应答（Poltorak, A. et. al.,1998）。

实际上，内**只是一大类能通过TLR受体家族激活先天**系统的供体中的一种。其它的供体还包括**共有的Lipopetide、脂蛋白（Lipoprotein）、鞭毛蛋白（Flagellin）（vison, S. M et. al.,2007）；革兰氏阴性菌的多聚甘露糖醛酸（Mannuronicacid polymer）、非典型脂多糖（Atypicallipopolysaccharide）、外膜脂蛋白A、膜孔道蛋白（Porin）、外膜蛋白A（Outer membraneprotein A）、菌体糖脂质（Glycolipid）、菌毛蛋白A（CsgA）；革兰氏阳性菌的肽聚糖、磷壁酸；分枝杆菌中特有的三乙酰化脂蛋白（Triacetylatedlipoprotein）、二乙酰化脂肽（Diacetylatedlipopeptide）、脂阿拉伯甘露糖（Lipoarabinomannan）、结核分支杆菌的结核素（STF）；支原体的二乙酰化脂肽；锥虫的糖肌醇磷脂（Glycoinositolphospholipids），弓形虫的Profilin-likeprotein；**的酵母聚糖；病毒的未甲基化CpG DNA、ssRNA、 dsRNA，某些病毒的膜蛋白与膜融合蛋白。

这些外源病原性的供体刺激TLR受体家族之后，共有4条信号通路，包括：1依赖于MyD88（骨髓分化基因）信号通路，这是主要通路；2不依赖于MyD88信号通路；3Small GTPase信号通路；4PIP信号通路。四条通路也相互偶联成网，激活后面的效应途径，包括有丝分裂原激活的蛋白激酶途径（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和NF-κB途径等等（Oda, Ket. al.,2006）。

一旦这些非特异性细胞**途径激活，作为检测特异性细胞**的ELISPOT检测必然会受到干扰。届时，我们将无法区别哪些斑点是特异性抗原刺激产生的，哪些是非特异性的细胞**反应产生的。所以，增加ELISPOT检测可信度，提高检测重复性的一个重要环节就是要严格控制好以内**为首的可能干扰ELISPOT检测的各种TLR供体。

l应对措施

实际实验中，*容易出现的TLR供体干扰来源是微生物的污染，包括**、**和酵母。为了尽可能避免内**对实验结果产生的干扰，重点要做好以下几个方面：

1选择高品质的ELISPOT试剂盒，试剂盒内的成分应该尽量完整。我们推荐达科为/U-Cytech公司的产品。该产品的质量已为国内客户多年的使用所证实，并且试剂盒内的各种成分非常齐备，除客户必须自备的Milli Q和PBS之外，客户不需要自行准备其它试剂，避免了引入各种TLR供体而干扰实验。

作为对比，BD公司和Diaclone公司的ELISPOT试剂需要客户自行准备封闭液以及抗体稀释液，Mabtech公司更是只提供抗体对。特别指出：自行准备的封闭液，封闭之后会直接接触检测细胞，引入受污染的微生物或者内**是很普遍的。这就会导致背景变脏，负对照产生额外的斑点，并且实验孔中特异性的斑点与非特异性的斑点混杂，*终影响整个实验的重复性与可信度。

ELISPOT检测中，无菌操作部分需要的各种溶液应该在洁净的空间内（比如超净台内）配制，尽量采用过滤**的方式。以未包被ELISPOT试剂为例，需要保持严格洁净的溶液有：润湿PVDF膜的酒精、洗涤用超纯水或者PBS、包被抗体以及抗体稀释液、封闭液、培养基、刺激物。

在洁净的空间内配制可以有效避免灰尘以及其它污染物。采用过滤**可以有效滤**体，如果用高压**，容易引起生物活性成分失活，而且死亡的菌体反而会释放出更多的TLR供体成分。

使用无内**的各种耗材、器皿。有些实验室习惯于使用一次性塑料耗材培养细胞或者做实验，这些耗材确实使用方便，并且能避免污染。但对于ELISPOT检测而言，*好选用已经表明不含热源的品牌。如果使用可重复使用的玻璃器皿，注意严格浸泡洗液，严格清洗。内**或者某些TLR供体的化学性质非常稳定，只有在浓硫酸/重铬酸钾的洗液中或者170°C烘烤4小时才会完全分解。

使用高质量的刺激物。

使用达优®无血清培养基。

*严格的无菌操作。

总之，内**以及其它TLR供体是ELISPOT检测中一大类干扰源。它们并不会导致ELISPOT检测的完全失败，故初学者这些干扰源不会太在意。但是要获得高质量的检测结果，增加实验的可信度与重复性，一个进阶的实验者必须考虑这些问题了。