ELISPOT斑点的特征

“一个阳性细胞，对应一个ELISPOT斑点”，这是ELISPOT检测的理论前提。无数的实验也证明了这一点。现有的抗体技术以及酶联放大技术确实可以把单个细胞分泌细胞因子的行为记录下来，ELISPOT板上的每一个斑点就是*好的证明。下面我们来看一看ELISPOT斑点的特征。

圆形，有晕核结构

这是判定真假ELISPOT斑点的主要标准。ELISPOT斑点有

这种结构可以从几何学的原理得到很好的理解和解释（如图

1.2所示）。悬浮在ELISPOT板膜上的细胞，它分泌细胞因子

是没有方向性的，均匀地向四面八方扩散，如果扩散到

ELISPOT板膜，就会被板膜上的包被抗体捕获。在所有从细胞到斑膜的路径中，有条路径*短，这就是位于细胞正下方到板膜的垂直距离。路径越短，扩散中耗散损失就越少，到达该点的细胞因子就越多，将来显色的时候颜色就越深。以垂直距离点为圆心，向外画一系列的同心圆，同心圆的直径越大，细胞因子扩散的距离就越长，耗散越多，到达的细胞因子就越少，颜色就越浅。当超过一定距离之后，扩散到达的细胞因子就减少到背景水平了，这就是斑点的边界。

大小不均一，正态分布

ELISPOT斑点要比产生它的那个细胞大很多。我们知道，

哺乳动物细胞的直径约是5-10μm，而ELISPOT斑点的直径通常是50-150μm，比细胞大10倍以上。

同一类阳性细胞，受到相同的刺激，产生的斑点大小也不完全相同。这些斑点大小不一，但是如果把它们的直径统计出来，这发现它们呈正态分布的，见图1.3。

需要说明的是，不同的细胞，对不同的刺激物，不同的细胞因子，ELISPOT斑点的直径（平均直径）也不同。通常来说，T细胞产生的斑点较大，单核巨噬细胞产生的斑点小；特异性的抗原（多肽或者蛋白）刺激产生的斑点大，非特异性的有丝分裂原（PHA、ConA等）刺激产生的斑点小；IFN-γ、IL-4等细胞因子的斑点大，IL-10、IL-12、Granzyme B之类的细胞因子的斑点小。

如果一次实验中有两类细胞同时受到刺激，比如T细胞与巨噬细胞，或者一次实验中T细胞受到两种不同的刺激物刺激，比如蛋白抗原与内**（大肠杆菌表达的蛋白很可能含有较高浓度的内**），那么同一个孔中就会出现两种不同的斑点。这两种斑点用肉眼很难区别，但是如果对它们直径分布做统计作图的话，就会有别于图1.3中的单峰分布，而是呈现双峰分布。