着床前小鼠胚胎线粒体功能障碍对着床胚胎与胎盘发育的影响

着床前小鼠胚胎线粒体功能障碍对着床胚胎与胎盘发育的影响

实验步骤

1. 胚胎培养基

用含4mg/ml BSA的MOPS-G1工作液收集受精卵。胚胎培养液分对照组培养液与试验组培养液(G1.2/G2.2，注：G1.2为对照组培养液；G2.2为试验组培养液)，其基本物质有：维生素和主要的氨基酸以及5%的人血清白蛋白(HSA)。试验组培养液不含有主要的丙酮酸盐，添加或不添加梯度的(0.5-500μm)线粒体MAS抑制剂Amino-oxyacetate(AOA)。此试验组培养液用来引起着床前胚胎不同水平的代谢紊乱。

2. 动物和胚胎收集

21日龄雌鼠CBAxC57BL/6腹腔注射5 IU eCG，48h后注射5 IU hCG，然后与公鼠CBAxC57BL/6合笼。见栓雌鼠，在hCG注射22h后脱颈处死，取输卵管，在MOPS-G1工作液中撕破膨大部，释放出卵丘卵母细胞，用0.5 mg/ml的透明质酸酶作用30s，获得裸卵。

3. 胚胎培养及线粒体功能抑制的体外模型获得

每20μl G1.2培养液放10枚受精卵，在37℃、5%O₂、6%CO₂条件下过夜培养。

培养22h后，获得的二细胞胚胎随机的分成三组，并用相应的培养液清洗：1)对照组：G1.2培养液(C)，2)不含丙酮酸钠的G1.2培养液，以使胚胎的代谢发生改变，3)含有0.5，5，50 或500μM 抑制剂AOA、不含丙酮酸钠的G1.2培养液，以抑制线粒体的MAS功能。二细胞胚胎在相应的培养液中培养24h，然后分别换相应的G2.2培养液(±丙酮酸钠和AOA)进行培养，直到囊胚阶段(第5d)。在第四天和第五天统计的胚胎发育率与第五天统计的囊胚情况进行评估分析。

4. 囊胚细胞数目与细胞分配的分析

用Hardy 等的试验方法，统计囊胚滋养外胚层和内细胞团的细胞数目。孵化期前，囊胚在4℃10mM TNBS中10min，然后在37℃ 0.1mg/ml anti-DNP-BSA中10min，后用37℃黑暗孵育5min以标记滋养外胚层细胞的核；要进一步标记ICM和TE细胞，用含6μg/ml双苯甲亚胺的乙醇处理，过夜。**天，胚胎用无水乙醇清洗，用甘油包埋，再在紫外荧光显微镜下观察。记录TE细胞(粉色)和ICM细胞(蓝色)的数目，并计算TE/ICM的比率。

5. 计算囊胚细胞凋亡

用一种原位细胞死亡诊断盒来评估囊胚的凋亡。凋亡细胞核用末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(TUNEL)进行荧光标记；用碘化丙啶标记所有的细胞。细胞总数及凋亡细胞核的数目可以用荧光显微镜进行观察记录；计算凋亡细胞的数目/相应的细胞总数得到凋亡细胞指数。

6. 计算呼吸率

每枚囊胚的呼吸率被视为线粒体氧化磷酸化能力的一个指标，呼吸率是用胚胎镜检测的。用12孔板，每孔中放一枚囊胚；每枚囊胚用各自的培养液作为工作液。将12孔板放到胚胎镜中，自动记录O₂消耗量(呼吸率)。当胚胎消耗氧气时，它能够在小孔中产生线性的浓度梯度。每个小孔中的氧气浓度事先用一种自动微传感器进行了**的周期性测量，以检测其线性梯度。这浓度梯度用来测量单枚胚胎的呼吸率。胚胎的氧气消耗量，大约每小时测量一次，连续测量三个小时；呼吸率为这三小时获得的每枚囊胚每秒钟消耗的氧气飞摩尔质量(fmol/sec)。

7. 碳水化合物代谢分析

利用之前所述方法，检测每枚胚胎经糖酵解途径的葡萄糖氧化率和经TCA循环途径的丙酮酸盐代谢率。每个1.6ml的离心管中放一枚囊胚，然后加入2μl相应的G2.2培养液，培养液中含0.5 μCi的[5-3H]葡萄糖(比活力为88.4mCi/mg)或0.35 μCi 的D-[6-14C]葡萄糖(比活力为302 μCi/mg)。糖酵解率和TCA途径代谢率分别利用3H₂O 和 14CO₂的产生获得，并用pmol/h表示。[加的都是葡萄糖，为什么说检测TCA途径的丙酮酸盐代谢率呢？TCA起始物是丙酮酸吧？葡萄糖可转化为丙酮酸盐]。

8. ATP和ADP的测定

利用Mitchell等的方法检测每枚囊胚的ATP、ADP以及ATP:ADP水平。每枚胚胎用100nl含有1mg/ml蔗聚糖的MOPS-G1萃取；然后用20nl 3M高氯酸黑暗孵育10min；之后用80nl 冰 KHCO₃(2M)中和高氯酸。利用己糖激酶和6-磷酸葡糖脱氢酶催化的酶联**反应或者乳酸脱氢酶和丙酮酸激酶催化的酶联**反应，经过萃取，用荧光显微镜分别对ATP和ADP浓度进行定量分析。ATP和ADP的浓度利用相关标准曲线计算，并用(pmol/每枚胚胎)表示。

9. 胚胎移植

6-12周龄的瑞士雌鼠与结扎公鼠合笼，假孕母鼠怀孕3.5天进行胚胎移植，每只假孕母鼠每侧**移入6枚囊胚期胚胎。每只假孕母鼠，随机的一侧**移入对照组胚胎，另一侧移入试验组胚胎(-P或是AOA)。胚胎的着床能力在小鼠怀孕的第18天，通过着床胚胎数量以及胚胎和胎盘情况的检测来评价。