利用荧光标记法测定细胞凋亡因子具体操作方法
利用荧光标记法测定细胞凋亡因子具体操作方法
一、仪器与试剂
1. TdT酶（25U/μl）；
2. 生物素标记的-dUTP（Biotin-dUTP）或地高辛标记的dUTP （Digoxingening-11-dUTP）1nmol/μl；
3. 反应缓冲液；
4. 洗涤缓冲液；
5. 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的亲合素或链霉亲合素 （2.5μg/ml）或抗地高辛抗体（1:30）；
6. PI染液（含PI 5μg/ml及0.1%无DNA酶活性的RNA酶）；
7. PBS缓冲液；
8. 塑料盖玻片；
9. 贴壁生长的培养细胞；
10. 悬浮生长培养细胞的甩片或涂片；冰冻切片；常规石蜡切片。
二、操作步骤
1. 固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4％多聚甲醛固定30min（4℃冰箱）后，用80%酒精再固定2h（-20℃冰箱）；常规4%中性福尔马林固定、石蜡切片进行脱蜡、水合； 2. 洗涤：将玻片浸入PBS缓冲液，摇床上洗涤5min，三次；
3. 反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50μl/cm2 滴加反应液（每50μl反应液含TdT酶0.5μl ，标记的-dUTP 1μl），使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上，盖上塑料盖玻片，置湿盒中，37℃孵育1h；
4. 终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置于盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤2次，每次5min；
5. FITC标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分，按50μl/cm2滴加FITC反应液（含FITC 2.5μg/ml），室温下避光孵育10min；
6. 洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗2次，每次5min；
7. PI复染：将玻片置于盛有PI染液的染色缸内，室温下避光染色30min 8. 封片：用盖玻片直接盖在含PI染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察；
三、结果判断
用荧光显微镜观察，选用蓝色激发光（波长488nm），所有的细胞核均被PI着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上FITC，显示出黄绿色荧光。
