核酸分离提取的原则

核酸分离提取的原则

核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些嗜菌体DNA有时为单链环状分子，RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子，不同类型的RNA分子可以具有不同的结构特点，如真核mRNA分子多数在3’端带有poly(A)结构，至于病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状及单链线状等。

95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。RNA分子则主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核内，15%在细胞器中，RNA以rRNA的数量*多（80％-85%），tRNA及核内小分子RNA占10%-15%，而mRNA分子大小不一，序列各异。总的来说，DNA分子的总长度一般随着生物的进化程度而增大，而RNA的分子量与生物进化无明显关系。

分离纯化核酸总的原则：1.应保证核酸上等结构的完整性；2.排除其它分子的污染。

为了保证核酸结构与功能的研究，完整的上等结构是*基本的要求，因为遗传信息全部贮存在上等结构之中，核酸的上等结构还决定其上等结构的形式以及和其它生物大分子结合的方式。对于核酸的纯化应达到

以下三点要求：

1.核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

2.其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到*低程度；

3.排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。

为了保证分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中，应注意以下事项：

1.尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；

2.减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4-10的条件下进行；

3.减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长的孔道，细胞突然置于低渗液中，细胞爆炸式破裂以及DNA样本的反复冻贮。这些操作细节在实验操作中应倍加注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA。对分子量小的环状DNA分子，如质粒DNA及RNA分子，威胁相对小些。高温如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取过程中，一般在低温操作，但现在发现在室温快速提取与低温提取，获得核酸的质量没有太大差异。

4.防止核酸的生物降解，细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的上等结构，其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2 、Ca2 的激活，使用EDTA、柠檬酸盐螯合金属二价离子，基本可以抑制DNA酶活性。而RNA酶不但分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，所以是生物降解RNA提取过程的主要危害因素。

核酸提取的主要步骤，无外乎破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质，纯化核酸等。核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定，对于某特定细胞器中富集的核酸分子，事先提取该细胞器，然后提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。