磷酸化蛋白Western Blot的注意事项

磷酸化蛋白Western Blot的注意事项

• 关于/磷酸化蛋白样品，裂解液问题

• 蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应，所以取样品的过程要迅速，样品要新鲜，样品处理*好在冰上操作，操作时间尽量短。用PBS洗涤细胞时，PBS一定要4℃预冷。如果是组织的话，提取蛋白时采用液氮研磨的方法，研磨器具*好提前预冷，保持低温的状态。
• 提取磷酸化蛋白的裂解液*好是新鲜配制，裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，否则即使条带压出来也会很浅，结果也不可信。okadaic acid，NaF是磷酸酶抑制剂。再者，还要看你检测的蛋白磷酸化位点是什么氨基酸，如果是酪氨酸还要加1 u M的sodium vanidate即原钒酸钠，上样前不要煮沸，煮沸可能会破坏其磷酸化位点。
• 提取的磷酸化蛋白一定要妥善保存，*好是收集完成后马上变性并于-80℃分装保存，以保证降解程度*小。同时避免反复冻溶导致磷酸基团的降解。
• 关于/Western Blot操作问题
• 磷酸化蛋白的表达丰度较低，一般只有总蛋白量的10%，甚至更低，一定要确保每个凝胶孔中有足够的目的蛋白上样量。
• 磷酸化蛋白容易脱磷酸化，除提取蛋白时要迅速小心外，也可在上样缓冲液和转移缓冲液中加入磷酸化酶抑制剂Na3VO4等。
• 磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。好抗体，傻瓜也能做出来，不好的抗体神仙也无办法。有些公司的抗体很好，有些公司的抗体很差（一些大公司同样会有低劣产品），而且这一点对非磷酸化的抗原检测也很重要。
• 因为磷酸化蛋白只占总蛋白量的极少部分，加入一抗后*好4℃过夜，保证抗体有充分的结合时间。4℃也可以使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化抗体都挺贵的。二抗则室温1h即可。4℃过夜，主要原因不是使抗体结合更好，而是蛋白抗原不容易从膜上脱落。蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附属热力学范畴，高温下容易脱落。而抗体-抗原结合是热力学与动力学问题，高温容易结合是热力学范畴，抗体、抗原浓度却是动力学范畴。膜上的抗原脱落了，结合效率会低。
• 磷酸化蛋白WB时，用洗涤液漂洗时也要注意一下，摇床的转速不要太快，洗的时间不要太长，孵育一抗和二抗之后分别洗3次，每次5min即可。宁愿深一些，总比做不出来强得多。另外，洗的时候，*好不要把几张膜叠在一起洗。
• 关于/磷酸化抗体的说明书
• 磷酸化抗体的说明书大家一定要仔细看，并*好根据厂商的操作说明来操作实验，这是实验成功的保证。因为不同的磷酸化抗体公司推荐的操作步骤不同。比如upstate的gamma-H2AX就需要脱脂奶粉封闭，一抗、二抗也需要脱脂奶粉配制；而CST的一些抗体则是脱脂奶粉封闭，一抗、二抗用BSA配制。其中原因不详，但是应该是非常关键的，我试过用BSA配gamma-H2AX，背景很高，目的条带非常淡。
• 关于/WB时背景和条带的问题
• 磷酸化蛋白WB时背景也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则背景太深盖住想要的那条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅。
• 洗涤液对*后的背景影响也较大，密理博（millipore）*近的说明书推荐用双蒸水洗涤，我对比了TBST洗涤的膜，效果有一定差距，背景有效降低，即便压片30min，背景仍然是可以忽略的。我想，双蒸水充分减少了ECL反映中其他缓冲液的影响，应该是可取的。
• 做磷酸化蛋白WB时，除了目标蛋白的条带以外，往往会出现非特异性的条带。磷酸化抗体不好的话，甚至会压出非特异性的条带，反而没有你想要的条带，所以压片后，一定要根据Markers比对一下你压出的条带分子量是否正确。
• 关于/蛋白总的表达量问题
• 研究完某一蛋白的磷酸化情况后*好也要研究一下该蛋白总的表达量。这有两种方法，一是：相同的样品在不同的孔中上样两次（可在相同的胶上，也可在不同的胶上），其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个胶，压内标。但是一般不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。因此，比较公认的，也是常用的方法，即用strip液将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去，然后用同一张膜压总蛋白。然后再洗脱一次，再压内标。
• 关于/Strip时的问题
• Strip时一定要注意，膜一定要完全泡在strip solution中（可用较硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受热均匀。这一点很重要，要不然，随后压出来的总蛋白也好，内标也好就会不均一，无法进行比较。
• strip液是用来去除已结合的抗体，但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。实验发现水浴有时温度不稳定，温度定为55℃时往往其温度容易超过，导致较多的蛋白也被去除，故建议温度设为50℃，30min，既能有效去除已结合的抗体，又比55℃更能保护蛋白。